HPLC — تحلیل چیست؟
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بر اساس عبور نمونه از یک ستون فشرده تحت فشار با فاز متحرک مایع است. قطعات با سرعت های متفاوتی بر اساس تمایلشان به فاز ساکن حرکت می کنند و در زمان های مختلف ستون را ترک می کنند. آنها با یک آشکارساز UV، DAD، فلورسانس یا ضریب شکست اندازه گیری می شوند.
هدف HPLC — تحلیل
هدف جداسازی ترکیبات حساس به حرارت یا غیر فرار بدون تجزیه آنها و تعیین مقدار آنها است. سنجش مواد فعال و پروفایل ناخالصی در داروها و تعیین افزودنی و ویتامین در غذا با این تکنیک انجام می شود.
HPLC — تحلیل بر چه محصولاتی اعمال می‌شود؟
- مواد فعال دارویی و محصولات نهایی
- افزودنی های غذایی، نگهدارنده ها و شیرین کننده ها
- آماده سازی ویتامین ها و مکمل ها
- نگهدارنده ها و فیلترهای UV در محصولات آرایشی و بهداشتی
- افزودنی های پلیمری و آنتی اکسیدان ها
HPLC — تحلیل در چه صنایعی کاربرد دارد؟
استانداردهای مرتبط با HPLC — تحلیل
- فارماکوپه اروپایی (Ph. Eur.) فصل کلی 2.2.29 — کروماتوگرافی مایع
- USP <621> (کروماتوگرافی)
- ICH Q2(R2) (اعتبارسنجی رویه های تحلیلی)
- EN 12856 / EN 12857 (تعیین شیرین کننده ها و افزودنی ها در مواد غذایی)
شرایط HPLC — تحلیل
- Kolon
- پر و اندازه تعریف شده در استاندارد روش
- Hareketli faz
- نسبت بافر به حلال آلی تعریف شده در روش. ایزوکراتیک یا گرادیان
- طول موج آشکارساز
- در روش با توجه به حداکثر جذب آنالیت مشخص شده است
- مناسب بودن سیستم
- معیارهای حلالیت، باطله و تکرارپذیری تعریف شده در فارماکوپه
تجهیزات HPLC — تحلیل
- پمپ فشار بالا و واحد گرادیان
- نمونه گیری خودکار
- کوره ستونی و ستون های تحلیلی
- آشکارساز UV / DAD / فلورسانس / RI
- سیستم داده کروماتوگرافی
الزامات نمونه برای HPLC — تحلیل
- نمونه باید در فاز متحرک قابل حل باشد
- فیلتراسیون (معمولاً 0.45 میکرومتر یا کمتر) برای جلوگیری از گرفتگی ستون مورد نیاز است
- آسیاب و استخراج برای اشکال دوز جامد اعمال می شود
- مقدار نمونه بر اساس فرمولاسیون متفاوت است. چند گرم به طور کلی کافی است
- اطلاعات ماده فعال و مواد کمکی باید به اشتراک گذاشته شود
مدت HPLC — تحلیل
یک دویدن به طور کلی بین 10 تا 60 دقیقه است. با آزمایش‌های تناسب سیستم، کالیبراسیون و تزریق‌های تکراری، گزارش‌های معمول چند روز کاری طول می‌کشد.
روش اجرای HPLC — تحلیل
- 1نمونه حل، رقیق و فیلتر می شود.
- 2استانداردهای کالیبراسیون تهیه شده است.
- 3تست تناسب سیستم انجام می شود و تجزیه و تحلیل تا زمانی که معیارها برآورده نشود ادامه نمی یابد.
- 4نمونه بر روی ستون تزریق می شود و کروماتوگرام ثبت می شود.
- 5پیک ها با زمان ماند مشخص می شوند.
- 6نواحی پیک با توجه به منحنی کالیبراسیون ارزیابی می شوند.
- 7نتیجه با نمونه های کنترل کیفیت تأیید می شود.
معیارهای پذیرش HPLC — تحلیل
محتوای ماده فعال و محدودیت های ناخالصی از دارونامه یا پرونده ثبت آمده است. در مواد غذایی و آرایشی مقررات افزودنی مربوطه اعمال می شود. خود روش محدودیتی تعریف نمی کند.
ارزیابی نتایج
نتایج از منحنی کالیبراسیون محاسبه می شود. در آزمایشگاهی که روش تأیید شده است، خطی بودن، بازیابی، تکرارپذیری و حد کمیت از قبل تعیین شده است. مقدار در گزارش در این محدوده معتبر معنادار است.
گزارش HPLC — تحلیل
- توضیحات نمونه، تاریخ دریافت و شماره آزمایشگاه
- روش اعمال شده و استاندارد مرجع، در صورت وجود
- شرایط ابزار و اندازه گیری
- مراحل آماده سازی نمونه
- نتایج و واحدهای اندازه گیری
- عدم قطعیت اندازه گیری (در صورت درخواست)
- بیانیه ای مبنی بر اینکه نتایج فقط به نمونه ارسال شده برای آزمایش مربوط می شود
اعتباربخشی
EUROLAB دارای اعتبار شناخته شده بین المللی است که از نهادهای اعتباربخشی طرف قراردادهای شناسایی چندجانبه IAF و ILAC، تحت ISO/IEC 17025 برای تست های آزمایشگاهی، ISO/IEC 17020 برای بازرسی و نظارت، و ISO/IEC 17021-1 و سیستم گواهی محصول ISO/IEC. این زنجیره تضمین می کند که گزارش ها و گواهی های صادر شده در سراسر جهان پذیرفته می شوند.
اینکه آیا این آزمون می تواند در محدوده معتبر ارائه شود به محصول شما و استاندارد اعمال شده بستگی دارد. از آنجایی که اعتبارسنجی مبتنی بر روش است، دامنه به صورت کتبی در مرحله نقل قول تأیید می شود.
محدوده و مجوزهامقررات مرتبط
- تک نگاری های فارماکوپه اروپایی و USP
- اتحادیه اروپا 1333/2008 (افزودنی های غذایی)
- اتحادیه اروپا 1223/2009 مقررات آرایشی و بهداشتی
- ICH Q3A / Q3B (ناخالصی ها)
صفحاتی که از این روش استفاده می شود
روش‌های تحلیلی — این گروه روش‌ها چه می‌کند؟
بخش زیر حوزه‌ای را توصیف می‌کند که آزمون HPLC — تحلیل به آن تعلق دارد؛ شرایط و معیارهای پذیرش این آزمون خاص در بخش‌های بالا آمده است. دامنه ویژه محصول شما در مرحله پیشنهاد قیمت به‌صورت مکتوب مشخص می‌شود.
صفحات روش تحلیلی صفحاتی درباره یک فن اندازه‌گیری هستند نه یک آزمون. این تفاوت مهم است: «آزمون مه نمکی» یک آزمون است و به یک پرسش پاسخ می‌دهد؛ «ICP-MS» یک فن است و در ده‌ها آزمون مختلف استفاده می‌شود. گاهی کاربر به‌دنبال آزمون نیست بلکه به‌دنبال فن است — زیرا نام روش چیزی است که در مشخصات او درج شده.
این تمایز در انتخاب آزمایشگاه تعیین‌کننده می‌شود. زمانی که مشتری درخواست «تحلیل فلزات سنگین» می‌کند، پرسش واقعی این است که با کدام فن انجام خواهد شد: XRF سریع و غیرمخرب است اما ترکیبات را تشخیص نمی‌دهد؛ AAS برای یک عنصر واحد مقرون‌به‌صرفه است؛ ICP-OES چند عنصر را غربالگری می‌کند؛ ICP-MS سطوح ناچیز را می‌بیند. همان نمونه در چهار فن نتایجی با حدود تشخیص و عدم قطعیت‌های متفاوت می‌دهد.
انتخاب روش بر اساس سه معیار انجام می‌شود. حد تشخیص: آیا غلظت موردنظر در محدوده‌ای است که روش می‌تواند ببیند؟ سازگاری ماتریس: آیا ماتریس نمونه (پلاستیک، غذا، خاک، فلز) از نوعی است که روش می‌تواند مدیریت کند، و آیا پیش‌تیمار لازم است؟ پیوند با مشخصات: آیا استاندارد محصول یا قانون روش خاصی را الزامی می‌کند؟ معیار سوم اغلب بر دو معیار اول غلبه می‌کند — مشخصات فنی روش را مقید می‌کند.
صفحات روش یک زنجیره می سازند. یک تکنیک به صفحات آزمایشی که در آن استفاده می‌شود، به استانداردهایی که آن تست‌ها بر آنها استوار است، به قوانین مرتبط با آن استانداردها و در نهایت به رژیم‌های دسترسی به بازار مرتبط است. زنجیره مثال در سند منبع به این صورت عمل می کند: XRF → تجزیه و تحلیل فلزات → انطباق با RoHS → محدودیت فلزات سنگین → صفحات پوشش. کاربر از هر لینکی که وارد شود، به دیگران می رسد.
آماده سازی نمونه نیمی از نتیجه نامرئی در این خانواده است و منبع خطای بیشتری نسبت به خود تکنیک است. روش هضم، درجه آسیاب، حلال استخراج و نسبت رقت به طور قابل توجهی نتیجه را تغییر می دهد. نمونه مشابه روی یک ابزار با آماده سازی متفاوت نتیجه متفاوتی می دهد. بنابراین تعریف روش آماده سازی را نیز پوشش می دهد.
کالیبراسیون و تأیید سومین مؤلفه تعیین کننده است. یک ابزار با مواد مرجع تایید شده کالیبره می شود، منحنی کالیبراسیون به صورت دوره ای تایید می شود و یک نمونه کنترل در هر دسته اجرا می شود. بدون این مراحل، عدد تولید شده قابل ردیابی نیست، حتی اگر ابزار به درستی کار کند.
گروه‌های روش در این حوزه
تحلیل عنصری
ICP-OES، ICP-MS، AAS و XRF. آنها در حد تشخیص، تحمل ماتریس و ظرفیت چند عنصری متفاوت هستند.
کروماتوگرافی
GC، GC-MS، HPLC، LC-MS/MS و کروماتوگرافی یونی. مخلوطی را به اجزای آن جدا می کند و هر کدام را جداگانه اندازه می گیرد.
طیف‌سنجی
FTIR، Raman، UV-Vis و انتشار نوری. برای هویت مواد، شناسایی گروه عملکردی و ترکیب آلیاژ.
تحلیل حرارتی
DSC، TGA، DMA و دیلاتومتری. دماهای انتقال، ترکیب، تجزیه و رفتار ابعادی.
میکروسکوپی و تصویربرداری
میکروسکوپ نوری، SEM-EDS، رادیوگرافی و توموگرافی. ساختار، عیوب و توزیع عنصری.
شیمی کلاسیک (تر)
تیتراسیون، وزن سنجی و رنگ سنجی. به عنوان یک روش مرجع و در تأیید نتایج ابزاری استفاده می شود.
موارد رایج اشتباه‌گرفته‌شده در این حوزه
- XRF یک ابزار غربالگری است. عناصر را می بیند و ترکیبات را تشخیص نمی دهد. تصمیم گیری در مورد یک ترکیب محدود نیاز به تأیید با شیمی مرطوب دارد.
- عبارت «تشخیص داده نشد» اثبات عدم وجود نیست؛ همراه با حد تشخیص روش خوانده می‌شود.
- مشخصات روش را مقید می کند. در صورتی که مشخصات به روش دیگری نیاز داشته باشد، روش فنی بهتر پذیرفته نمی شود.
- آماده سازی نمونه بخشی از نتیجه است. گزارشی که آماده سازی را بیان نمی کند قابل تکرار نیست.
- نتایج به دست آمده توسط تکنیک های مختلف را نمی توان به طور مستقیم با هم مقایسه کرد. حدود تشخیص و عدم قطعیت آنها متفاوت است.
- صفحه روش یک صفحه آزمایشی نیست. کدام روش برای کدام آزمایش از استاندارد محصول استفاده می شود.
این نتایج از کدام تصمیم پشتیبانی می‌کنند
- تطبیق روش نوشته‌شده در مشخصات با دامنه آزمایشگاه
- انتخاب روش بر اساس حد تشخیص و سازگاری ماتریس
- تأیید نتیجه ابزاری با روش مرجع
- رفع انحرافات ناشی از آماده‌سازی نمونه
تست های مرتبط
پرسش‌های متداول درباره HPLC — تحلیل
تفاوت HPLC و UPLC چیست؟
اصل اساسی یکسان است. UPLC با بسته بندی ذرات کوچکتر و فشار بالاتر عمل می کند. جداسازی سریعتر با قله های تیزتر کامل می شود. انتقال در صورتی امکان پذیر است که روش داروسازی اجازه تغییر ستون را بدهد.
چرا تست تناسب سیستم اجباری است؟
این نشان می دهد که سیستم کروماتوگرافی، در آن روز با آن ستون، می تواند به جداسازی مورد انتظار دست یابد. نتیجه ای که بدون رعایت معیارها به دست می آید معتبر نیست.