HPLC-Analyse

Was ist HPLC-Analyse?

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie basiert darauf, dass die Probe unter Druck mit einer flüssigen mobilen Phase durch eine gepackte Säule geleitet wird. Die Komponenten bewegen sich entsprechend ihrer Affinität zur stationären Phase mit unterschiedlicher Geschwindigkeit und verlassen die Säule zu unterschiedlichen Zeiten; Sie werden mit einem UV-, DAD-, Fluoreszenz- oder Brechungsindexdetektor gemessen.

Zweck von HPLC-Analyse

Ziel ist es, thermisch labile oder nichtflüchtige Verbindungen zersetzungsfrei abzutrennen und deren Menge zu bestimmen. Mit dieser Technik werden Wirkstoffbestimmungen und Verunreinigungsprofile in Arzneimitteln sowie die Bestimmung von Zusatzstoffen und Vitaminen in Lebensmitteln durchgeführt.

Bei welchen Produkten wird HPLC-Analyse angewendet?

Pharmazeutische Wirkstoffe und Fertigprodukte
Lebensmittelzusatzstoffe, Konservierungsstoffe und Süßstoffe
Vitaminpräparate und Nahrungsergänzungsmittel
Konservierungsstoffe und UV-Filter in Kosmetikprodukten
Polymeradditive und Antioxidantien

In welchen Branchen wird HPLC-Analyse eingesetzt?

ChemieArzneimittelLebensmittelKosmetikaUmweltBiotechnologieEinzelhandel

Normen zu HPLC-Analyse

Europäisches Arzneibuch (Ph. Eur.), allgemeines Kapitel 2.2.29 — Flüssigkeitschromatographie
USP <621> (Chromatographie)
ICH Q2(R2) (Validierung analytischer Verfahren)
EN 12856 / EN 12857 (Bestimmung von Süßungsmitteln und Zusatzstoffen in Lebensmitteln)

Prüfbedingungen für HPLC-Analyse

Kolon: Füllung und Größe sind im Methodenstandard definiert
Hareketli faz: In der Methode definiertes Puffer/organisches Lösungsmittel-Verhältnis; isokratisch oder Gradient
Detektorwellenlänge: Sie wird in der Methode entsprechend dem Absorptionsmaximum des Analyten angegeben
Systemtauglichkeit: Im Arzneibuch definierte Löslichkeits-, Tailing- und Reproduzierbarkeitskriterien

Prüfgerät für HPLC-Analyse

Hochdruckpumpe und Gradienteneinheit
Autosampler
Säulenofen und analytische Säulen
UV-/DAD-/Fluoreszenz-/RI-Detektor
Chromatographie-Datensystem

Probenanforderungen für HPLC-Analyse

Die Probe muss in der mobilen Phase löslich gemacht werden
Um ein Verstopfen der Säule zu verhindern, ist eine Filtration (im Allgemeinen 0,45 µm oder weniger) erforderlich
Bei festen Darreichungsformen werden Mahlung und Extraktion angewendet
Die Probenmenge variiert je nach Formulierung; ein paar Gramm reichen im Allgemeinen aus
Informationen zu Wirk- und Hilfsstoffen müssen weitergegeben werden

Dauer von HPLC-Analyse

Ein einzelner Lauf dauert im Allgemeinen zwischen 10 und 60 Minuten. Mit Systemeignungstests, Kalibrierung und Wiederholungsinjektionen dauert die routinemäßige Berichterstattung einige Arbeitstage.

Ablauf von HPLC-Analyse

1Die Probe wird gelöst, verdünnt und filtriert.
2Kalibrierstandards werden vorbereitet.
3Es wird ein Systemeignungstest durchgeführt und die Analyse wird erst fortgesetzt, wenn die Kriterien erfüllt sind.
4Die Probe wird auf die Säule injiziert und das Chromatogramm aufgezeichnet.
5Peaks werden anhand der Retentionszeit identifiziert.
6Peakflächen werden entsprechend der Kalibrierungskurve ausgewertet.
7Das Ergebnis wird anhand von Qualitätskontrollproben überprüft.

Annahmekriterien für HPLC-Analyse

Wirkstoffgehalt und Verunreinigungsgrenzwerte ergeben sich aus dem Arzneibuch oder dem Registrierungsdossier; In Lebensmitteln und Kosmetika gilt die entsprechende Zusatzstoffverordnung. Die Methode selbst definiert keinen Grenzwert.

Auswertung der Ergebnisse

Die Ergebnisse werden anhand der Kalibrierungskurve berechnet. In einem Labor, in dem die Methode validiert wurde, werden zuvor Linearität, Wiederfindung, Wiederholbarkeit und die Bestimmungsgrenze festgelegt; Der Wert im Bericht ist innerhalb dieses validierten Bereichs aussagekräftig.

Prüfbericht zu HPLC-Analyse

Probenbeschreibung, Eingangsdatum und Labornummer
Angewendete Methode und Referenzstandard, falls vorhanden
Geräte- und Messbedingungen
Schritte zur Probenvorbereitung
Messergebnisse und Einheiten
Messunsicherheit (falls gewünscht)
Eine Aussage, dass sich die Ergebnisse nur auf die zum Test eingereichte Probe beziehen

Akkreditierung

EUROLAB verfügt über eine international anerkannte Akkreditierung, die von Akkreditierungsstellen erhalten wurde, die Vertragspartei der multilateralen Anerkennungsvereinbarungen IAF und ILAC sind, gemäß ISO/IEC 17025 für Labortests, ISO/IEC 17020 für Inspektion und Überwachung sowie ISO/IEC 17021-1 und ISO/IEC 17065 für System- und Produktzertifizierung. Diese Kette stellt sicher, dass die ausgestellten Berichte und Zertifikate weltweit akzeptiert werden.

Ob dieser Test im akkreditierten Rahmen angeboten werden kann, hängt von Ihrem Produkt und der angewandten Norm ab; Da die Akkreditierung methodenbasiert erfolgt, wird der Umfang bereits im Angebotsstadium schriftlich bestätigt.

Geltungsbereich und Berechtigungen

Seiten, auf denen diese Methode verwendet wird

Analysemethoden — Was leistet diese Methodengruppe?

Der folgende Abschnitt beschreibt das Gebiet, zu dem der Test HPLC-Analyse gehört; die Bedingungen und Abnahmekriterien dieses konkreten Tests stehen in den obigen Abschnitten. Der für Ihr Produkt spezifische Umfang wird schriftlich im Angebotsstadium festgelegt.

Seiten zu Analysemethoden sind Seiten über eine MESSTECHNIK, nicht über eine Prüfung. Dieser Unterschied ist wichtig: „Salznebelprüfung" ist eine Prüfung und beantwortet eine Frage; „ICP-MS" ist eine Technik und wird in Dutzenden verschiedener Prüfungen eingesetzt. Manchmal sucht der Nutzer nicht die Prüfung, sondern die Technik — weil der Methodenname in seiner Spezifikation steht.

Diese Unterscheidung wird bei der Wahl eines Labors entscheidend. Wenn ein Kunde nach einer „Schwermetallanalyse" fragt, lautet die eigentliche Frage, mit welcher Technik sie durchgeführt wird: RFA ist schnell und zerstörungsfrei, unterscheidet aber nicht zwischen Verbindungen; AAS ist wirtschaftlich für ein einzelnes Element; ICP-OES erfasst mehrere Elemente; ICP-MS erkennt Spurenwerte. Dieselbe Probe liefert bei den vier Techniken Ergebnisse mit unterschiedlichen Nachweisgrenzen und unterschiedlichen Unsicherheiten.

Die Methodenwahl erfolgt anhand dreier Kriterien. NACHWEISGRENZE: Liegt die gesuchte Konzentration innerhalb des Bereichs, den die Methode erfassen kann? MATRIXVERTRÄGLICHKEIT: Ist die Probenmatrix (Kunststoff, Lebensmittel, Boden, Metall) eine, die die Methode bewältigen kann, und ist eine Vorbehandlung erforderlich? SPEZIFIKATIONSBINDUNG: Schreibt die Produktnorm oder Gesetzgebung eine bestimmte Methode vor? Das dritte Kriterium setzt sich oft gegenüber den ersten beiden durch — die Spezifikation bindet die Methode.

Methodenseiten bilden eine KETTE. Eine Technik ist mit den Testseiten, auf denen sie verwendet wird, mit den Standards, auf denen diese Tests basieren, mit der Gesetzgebung, an die diese Standards gebunden sind, und letztendlich mit Marktzugangsregelungen verknüpft. Die Beispielkette im Quelldokument funktioniert wie folgt: RFA → Metallanalyse → RoHS-Konformität → Schwermetallbeschränkung → Beschichtungsseiten. Über welchen Link der Benutzer auch immer einsteigt, er gelangt zu den anderen.

Die Probenvorbereitung ist in dieser Familie die unsichtbare Hälfte des Ergebnisses und stellt eine größere Fehlerquelle dar als die Technik selbst. Die Aufschlussmethode, der Mahlgrad, das Extraktionslösungsmittel und das Verdünnungsverhältnis verändern das Ergebnis deutlich. Dieselbe Probe auf demselben Gerät liefert bei unterschiedlicher Vorbereitung ein anderes Ergebnis; Die Definition der Methode umfasst daher auch die Vorbereitung.

Kalibrierung und Verifizierung sind die dritte entscheidende Komponente. Ein Instrument wird mit zertifiziertem Referenzmaterial kalibriert, die Kalibrierungskurve wird regelmäßig überprüft und in jeder Charge wird eine Kontrollprobe durchgeführt. Ohne diese Schritte ist eine produzierte Nummer nicht rückverfolgbar, selbst wenn das Gerät ordnungsgemäß funktioniert.

Methodengruppen in diesem Bereich

Elementanalyse
ICP-OES, ICP-MS, AAS und RFA. Sie unterscheiden sich in der Nachweisgrenze, der Matrixtoleranz und der Multielementkapazität.
Chromatographie
GC, GC-MS, HPLC, LC-MS/MS und Ionenchromatographie. Es zerlegt ein Gemisch in seine Bestandteile und misst diese einzeln.
Spektroskopie
FTIR, Raman, UV-Vis und optische Emission. Zur Materialidentität, Identifizierung funktioneller Gruppen und Legierungszusammensetzung.
Thermische Analyse
DSC, TGA, DMA und Dilatometrie. Übergangstemperaturen, Zusammensetzung, Zersetzung und Dimensionsverhalten.
Mikroskopie und Bildgebung
Optische Mikroskopie, SEM-EDS, Radiographie und Tomographie. Struktur, Defekte und Elementverteilung.
Klassische (Nass-)Chemie
Titration, Gravimetrie und Kolorimetrie. Wird als Referenzmethode und zur Bestätigung instrumenteller Ergebnisse verwendet.

Häufig verwechselt in diesem Bereich

RFA ist ein Screening-Tool; es sieht Elemente und unterscheidet keine Verbindungen. Eine Entscheidung über eine eingeschränkte Verbindung erfordert eine Bestätigung durch Nasschemie.
Die Formulierung „nicht nachweisbar" ist kein Beweis für Abwesenheit; sie wird zusammen mit der Nachweisgrenze der Methode gelesen.
Die Spezifikation bindet die Methode. Eine technisch bessere Methode wird nicht akzeptiert, wenn die Spezifikation eine andere erfordert.
Zum Ergebnis gehört die Probenvorbereitung; Ein Bericht, in dem die Zubereitung nicht angegeben ist, ist nicht reproduzierbar.
Mit verschiedenen Techniken erzielte Ergebnisse können nicht direkt verglichen werden; ihre Nachweisgrenzen und Unsicherheiten sind unterschiedlich.
Eine Methodenseite ist keine Testseite; Welche Methode für welchen Test gilt, ergibt sich aus der Produktnorm.

Welche Entscheidungen diese Ergebnisse unterstützen

Abgleich der in der Spezifikation genannten Methode mit dem Laborumfang
Methodenauswahl nach Nachweisgrenze und Matrixkompatibilität
Bestätigung eines instrumentellen Ergebnisses mit einer Referenzmethode
Beseitigung von Abweichungen durch die Probenvorbereitung

Häufige Fragen zu HPLC-Analyse

Was ist der Unterschied zwischen HPLC und UPLC?

Das Grundprinzip ist das gleiche. UPLC arbeitet mit kleinerer Partikelpackung und höherem Druck; Die Trennung erfolgt schneller und die Peaks sind schärfer. Eine Übertragung ist möglich, wenn die Arzneibuchmethode einen Säulenwechsel zulässt.

Warum ist eine Systemeignungsprüfung obligatorisch?

Es zeigt, dass das chromatographische System an diesem Tag mit dieser Säule die erwartete Trennung erreichen kann. Ein Ergebnis, das ohne Erfüllung der Kriterien erzielt wird, wird nicht als gültig akzeptiert.