Endotoxintest — EP 2.6.14 / USP <85> / ANSI AAMI ST72 · Pharmazeutische Analyse

Was ist Endotoxin?

Der Endotoxintest misst die Menge an Lipopolysaccharid (Endotoxin), die aus der Zellwand gramnegativer Bakterien stammt. Endotoxin ist hitzebeständig: Durch die Sterilisation wird das Bakterium abgetötet, das Endotoxin wird jedoch nicht zerstört. Ein steriles Produkt kann daher dennoch pyrogen sein und muss gesondert getestet werden.

Zweck von Endotoxin

Damit soll nachgewiesen werden, dass der Endotoxingehalt in Geräten, die über den Blutkreislauf, die Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit oder durch Implantation mit dem Körper in Kontakt kommen, unter dem zulässigen Grenzwert liegt.

Bei welchen Produkten wird Endotoxin angewendet?

Intravenöse Katheter und Infusionssets
Implantate
Dialysesets
Chirurgische Instrumente und Sets
Geräte, die mit Liquor cerebrospinalis in Kontakt kommen

In welchen Branchen wird Endotoxin eingesetzt?

Medizinisches GerätGesundheitspflegeArzneimittel

Normen zu Endotoxin

EP 2.6.14
USP <85>
ANSI/AAMI ST72
ISO 11737-3

Prüfbedingungen für Endotoxin

Verfahren: Gel-Clot-, turbidimetrische oder chromogene LAL-Methoden
Extraktion: Die körperberührenden Oberflächen des Produkts werden mit endotoxinfreiem Wasser abgesaugt
Interferenzkontrolle: Es muss sichergestellt werden, dass das Produkt den Test nicht hemmt oder verstärkt

Prüfgerät für Endotoxin

LAL-Testkits und Reagenzien
Endotoxinfreie Glaswaren
Mikroplatten-Reader (für kinetische Methoden)
Trockenofen (zur Entpyrogenisierung)
Temperaturgesteuerter Inkubator

Probenanforderungen für Endotoxin

Das endgültige, sterilisierte Produkt
Die körperberührende Oberfläche muss bekannt sein
Die Anzahl der Proben richtet sich nach dem Arzneibuch und den Chargenangaben
Die Probe muss in endotoxinfreien Behältern vorbereitet und transportiert werden

Dauer von Endotoxin

Der erste Test, einschließlich der Interferenzstudie (Hemmung/Verstärkung), dauert mehrere Tage; Routinetests sind kürzer.

Ablauf von Endotoxin

1Der Endotoxingrenzwert für das Produkt wird berechnet.
2Es wird eine Interferenzstudie durchgeführt oder es wird auf eine bestehende Studie verwiesen.
3Das Produkt wird mit endotoxinfreiem Wasser extrahiert.
4Der Extrakt wird mit dem LAL-Reagenz gemischt.
5Es wird bei der definierten Temperatur inkubiert.
6Je nach Methode werden Gerinnselbildung, Trübung oder Farbentwicklung gemessen.
7Die Endotoxinmenge wird aus der Standardkurve berechnet.

Annahmekriterien für Endotoxin

Das Akzeptanzkriterium ist der für das Produkt berechnete Endotoxingrenzwert. Dieser Grenzwert wird anhand der im Arzneibuch definierten Formel berechnet, basierend auf dem Kontaktweg des Geräts und dem Gewicht des Patienten; Bei Geräten, die mit Liquor in Kontakt kommen, liegt der Grenzwert deutlich niedriger.

Auswertung der Ergebnisse

Das Ergebnis wird mit dem berechneten Grenzwert verglichen. Wenn die Interferenzstudie nicht valide ist, kann das Ergebnis nicht interpretiert werden; Wenn das Produkt die LAL-Reaktion unterdrückt, muss ein Verdünnungsfaktor bestimmt werden.

Prüfbericht zu Endotoxin

Angewandtes Arzneibuch und Methode
Probenbeschreibung, Charge und Oberfläche
Berechneter Endotoxingrenzwert
Ergebnis der Interferenzstudie und Verdünnungsfaktor
Gemessener Endotoxinwert (EU/Gerät oder EU/ml)
Vergleich mit dem Limit

Akkreditierung

EUROLAB verfügt über eine international anerkannte Akkreditierung, die von Akkreditierungsstellen erhalten wurde, die Vertragspartei der multilateralen Anerkennungsvereinbarungen IAF und ILAC sind, gemäß ISO/IEC 17025 für Labortests, ISO/IEC 17020 für Inspektion und Überwachung sowie ISO/IEC 17021-1 und ISO/IEC 17065 für System- und Produktzertifizierung. Diese Kette stellt sicher, dass die ausgestellten Berichte und Zertifikate weltweit akzeptiert werden.

Ob dieser Test im akkreditierten Rahmen angeboten werden kann, hängt von Ihrem Produkt und der angewandten Norm ab; Da die Akkreditierung methodenbasiert erfolgt, wird der Umfang bereits im Angebotsstadium schriftlich bestätigt.

Geltungsbereich und Berechtigungen

Pharmazeutische Analyse — Was umfasst dieser Prüfbereich?

Der folgende Abschnitt beschreibt das Gebiet, zu dem der Test Endotoxin gehört; die Bedingungen und Abnahmekriterien dieses konkreten Tests stehen in den obigen Abschnitten. Der für Ihr Produkt spezifische Umfang wird schriftlich im Angebotsstadium festgelegt.

Die pharmazeutische Analyse dient der Bestimmung der Identität, Reinheit, Menge und des Verhaltens des Wirkstoffs und des Fertigarzneimittels. Das Besondere an diesem Bereich ist, dass die Methoden weitgehend in den PHARMAKOPÖEN definiert sind: Sowohl die Europäische Pharmakopöe (Ph. Eur.) als auch die Pharmakopöe der Vereinigten Staaten (USP) legen sowohl die Methode als auch den Rahmen für die Anerkennung fest.

Die Verbindlichkeit der Pharmakopöe-Methode bestimmt die Arbeitsweise in diesem Bereich. Während in anderen Branchen das Labor eine geeignete Methode auswählen kann, ist hier die in der Monografie beschriebene Methode maßgebend; soll eine alternative Methode verwendet werden, muss deren Gleichwertigkeit nachgewiesen werden. Dies gewährleistet, dass die Ergebnisse weltweit vergleichbar sind.

Die Analysen werden in mehreren Gruppen durchgeführt. Die Identifizierung und Quantifizierung (HPLC, UV, Titration) zeigen, um welches Produkt es sich handelt und wie viel Wirkstoff es enthält. Das Verunreinigungsprofil und die Untersuchung auf Lösungsmittelrückstände dienen der Erkennung unerwünschter Verbindungen, die aus dem Herstellungsprozess stammen. Elementverunreinigungen beziehen sich auf Metalle, die aus Katalysatoren und Anlagen stammen. Das Auflösungs- und Verteilungsverhalten ist der wichtigste In-vitro-Indikator für das Freisetzungsverhalten des Arzneimittels im Körper.

Der Auflösungsversuch ist eine der wichtigsten Messungen in diesem Bereich. Es reicht nicht aus, dass eine Tablette die richtige Menge an Wirkstoff enthält; dieser Wirkstoff muss sich auch mit der richtigen Geschwindigkeit auflösen. Das Auflösungsprofil wird zur Bewertung der Auswirkungen von Änderungen an der Formulierung auf die Bioverfügbarkeit herangezogen und spielt bei der Zulassung von Generika eine zentrale Rolle.

Die VALIDIERUNG DER METHODE ist in dieser Produktfamilie ein obligatorischer Schritt. Wird eine Pharmakopöe-Methode verwendet, wird überprüft, ob die Methode unter den Bedingungen des jeweiligen Labors ordnungsgemäß funktioniert. Wurde eine eigene Methode entwickelt, wird diese anhand von Parametern wie Linearität, Präzision, Richtigkeit, Selektivität, Nachweis- und Bestimmungsgrenze sowie Robustheit validiert. Ergebnisse, die mit einer nicht validierten Methode erzielt wurden, dürfen nicht in den Zulassungsunterlagen verwendet werden.

Stabilitätsuntersuchungen bestimmen die Haltbarkeitsdauer und sind der zeitaufwändigste Arbeitsschritt in diesem Bereich. Das Produkt wird unter den für das jeweilige Produkt festgelegten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen gelagert, in bestimmten Abständen analysiert, und die Ergebnisse dienen als Grundlage für die Angabe der Haltbarkeitsdauer und der Lagerbedingungen. Beschleunigte Tests liefern zwar erste Anhaltspunkte, doch entscheidend sind die Echtzeitdaten.

Der mikrobiologische Bereich ist ein eigenständiger Teilbereich: Bestimmung der Keimzahl, Nachweis bestimmter Mikroorganismen, Sterilitätsprüfung bei sterilen Produkten und Prüfung auf bakterielle Endotoxine. Bei sterilen Produkten kommen zudem die Überprüfung der Verpackungsintegrität und die Sterilisationsvalidierung hinzu.

Die Datenintegrität ist in den letzten Jahren in den Mittelpunkt der Inspektionen gerückt. Es genügt nicht, dass das Ergebnis korrekt ist; die Rohdaten müssen rückverfolgbar, unveränderbar und prüfbar sein. Die Validierung elektronischer Aufzeichnungssysteme ist daher zu einem untrennbaren Teil der Analyse geworden.

Methodengruppen in diesem Bereich

Identität und Gehalt
HPLC, UPLC, UV-Vis-Spektrophotometrie, Titration, Identitätsbestätigung mittels FTIR.
Verunreinigungen und Rückstände
Verwandte Verunreinigungen, Abbauprodukte, Restlösungsmittel (GC-Headspace), Nitrosamin-Screening.
Elementverunreinigungen
Bestimmung von Elementverunreinigungen mittels ICP-MS und ICP-OES sowie zugehörige Risikobewertung.
Physikalisch-chemisch
Freisetzung und Zerfall, Härte, Abrieb, Gleichförmigkeit der Dosiereinheiten, Wassergehalt (Karl Fischer), Partikelgröße.
Mikrobiologisch
Mikrobielle Keimzahlbestimmung, spezifizierte Mikroorganismen, Sterilität, bakterielles Endotoxin, Konservierungsmittelwirksamkeit.
Stabilität
Echtzeit- und beschleunigte Stabilitätsstudien; Photostabilität und Stabilität während der Anwendung.

Häufig verwechselt in diesem Bereich

Die Arzneibuchmethode ist bindend; eine alternative Methode darf nur durch Nachweis ihrer Gleichwertigkeit verwendet werden.
Ein ohne Methodenvalidierung erzeugtes Ergebnis darf nicht in einem Zulassungsdossier verwendet werden.
Die beschleunigte Stabilität ersetzt nicht die Echtzeitdaten; die Haltbarkeit wird durch Echtzeitergebnisse gestützt.
Das Freisetzungsprofil ist empfindlich gegenüber Apparatetyp, Rührgeschwindigkeit und Medium; die Bedingungen müssen im Bericht vollständig sein.
Ein Mangel an Datenintegrität führt bei einer Inspektion zu einer Nichtkonformität, selbst wenn das Ergebnis korrekt ist.
Eine Änderung der Formulierung oder des Lieferanten erfordert einen analytischen Vergleich und, falls erforderlich, eine neue Stabilitätsstudie.

Welche Entscheidungen diese Ergebnisse unterstützen

Zulassungsdossier und Chargenfreigabe
Bestimmung von Haltbarkeit und Lagerbedingungen
Methodentransfer und Methodenvalidierung
Wareneingangskontrolle von Rohstoffen der Lieferanten
Bewertung der Auswirkung einer Formulierungsänderung auf die Bioäquivalenz

Häufige Fragen zu Endotoxin

Mein Produkt ist steril – warum ist ein Endotoxintest erforderlich?

Endotoxin ist hitzebeständig; Obwohl die Sterilisation das Bakterium abtötet, wird Endotoxin, ein Zellwandrückstand, nicht abgebaut. Ein steriles Produkt kann daher immer noch eine pyrogene Reaktion hervorrufen und Endotoxin muss separat gemessen werden.

Wie wird der Endotoxingrenzwert bestimmt?

Sie wird anhand der im Arzneibuch definierten Formel berechnet, basierend auf dem Kontaktweg des Geräts und der zulässigen Dosis. Für Geräte, die mit Liquor cerebrospinalis in Kontakt kommen, liegt der Grenzwert deutlich niedriger; die Berechnung muss im Bericht ausgewiesen werden.

Endotoxin